特别关注 | PARP抑制剂的工作原理究竟是什么？-甫康

二磷酸腺苷核糖基化（ADP-ribosylation）是一种最早于1963年报道的蛋白质翻译后修饰（PTM）。这种修饰由NAD+作为供体，聚ADP核糖聚合酶PARPs（Poly ADP-ribose polymerases）作为合成酶将ADP-ribose连接到目的蛋白上。PARylation（Poly-ADP-ribosylation，聚二磷酸腺苷核糖基化）修饰广泛参与到DNA损伤修复、转录调控、染色体蛋白重构等重要的生物学过程【1】。PARP1作为家族蛋白中被最广泛研究的重要成员，在一系列细胞应激过程，特别是DNA损伤修复中起了至关重要的作用。在基因毒性的胁迫（genotoxic stress）下，PARP1被招募到有缺口的DNA中并被迅速激活，导致包括其自身在内的多种蛋白发生PARylation修饰，从而启动DNA修复机制。因此，PARP1在介导DNA修复中的关键作用为开发PARP1抑制剂治疗人类恶性肿瘤提供了理论依据。尤其是双链断裂（DSB）修复缺陷的癌细胞，如BRCA1/2突变细胞，基于“合成致死”的机理，对PARP1抑制剂格外敏感。因此，PARP1也成为炙手可热的癌症治疗靶点。短短几年中，已经有4种小分子PARP1抑制剂（PARPi）成为美国FDA批准的抗癌药物。这些药物在BRCA1/2突变的卵巢癌和/或乳腺癌治疗中已经表现出很好的临床治疗效果。此外，最近的临床试验表明，PARP1抑制剂在其他的BRCA突变的癌症中，包括前列腺癌和胰腺癌中都是显示了非常好的前景。

现有的PARP1抑制剂都是NAD+竞争性的小分子。这些药物开发的初衷都是基于相对简单的PARP催化抑制（PARP catalytic inhibition）原理。正因于此，最初对于PARPi作用机制的研究也主要针对于PARP1催化活性的研究。然而PARylation作为一类重要的蛋白翻译后修饰，对其修饰的目的蛋白的认识却曾一度处于停滞阶段。其原因在于PARylation修饰非常复杂，使得质谱技术鉴定目的蛋白及相应修饰位点都存在巨大的困难。其主要困难体现在四个方面。第一，被修饰的蛋白含量仅占很小的比例，而之前并没有很好的针对PARylation的富集方法；第二，PARylation这种修饰的异质性很高，链的长度可达数百个ADP-ribose单体，而且可以以线性或者分支形式延伸，导致后续质谱分析时缺乏固定的质量变化；第三，修饰形成的化学键非常不稳定并且目的蛋白被修饰的氨基酸位点种类很多；第四，长链的PARylation因为含有大量的磷酸根而变的非常酸性（带负电），使得被修饰的肽段很难离子化（一般蛋白质组学都使用正极性离子源）。

2013年，余永豪课题组在Nature methods上发表了题为“Site-specific characterization of the Asp- and Glu-ADP-ribosylated proteome”的研究论文【2】（图1）（第一作者为章丫捷博士）。研究人员开发了针对天冬氨酸、谷氨酸修饰位点的二磷酸腺苷核糖基化（ADP-ribosylation）全蛋白质组的鉴定方法。首先，研究人员开发了一个基于硼酸的二磷酸腺苷核糖基化肽段的富集方法。接着，天冬氨酸/谷氨酸与ADP-ribose形成的酯键很容易被羟胺（NH2OH）攻击，产生一个具有15.0109道尔顿大小的衍生物（异羟肟酸），以此来去除复杂的PAR链。此外，这个异羟肟酸的衍生物非常稳定，也不影响离子化。作者利用此项研究共鉴定到包含1048个被修饰位点的340个目的蛋白。运用定量蛋白质组学结合羟胺衍生的方法，余永豪组进一步大规模表征了对于PARP抑制剂敏感的二磷酸腺苷核糖基化修饰位点，揭示了不同的PARP抑制剂对下游的敏感位点的差异分布。特别值得一提的是，基于此平台，研究人员证实：此前的一个被认为是PARP抑制剂的化合物Iniparib完全不具有影响二磷酸腺苷核糖基化修饰的功能。此化合物因此被证实不是一个真实的PARP抑制剂，而所有针对此化合物的临床试验也已经停止。因此，此质谱技术的建立，对于推动ADP-ribosylation修饰领域的研究发展以及PARP催化抑制（PARP catalytic inhibition）原理的机制研究有着重要作用。

基于此项独创的质谱技术平台，2016年，余永豪课题组与Lee Kraus课题组合作，在Science上发表了题为“Chemical genetic discovery of PARP targets reveals a role for PARP-1 in transcription elongation”的研究论文【3】（图1）。此项工作合成了与NAD+类似物结合的多种PARPs，分别与细胞核提取物孵育，在体外完成ADP-ribosylation反应，并运用上述质谱方法，来鉴定PARP1/2/3各自的底物以及相应的修饰位点。研究人员发现，PARP1可以修饰调控RNA聚合酶II活动的重要蛋白复合体NELF（Negative Elongation Factor），使其脱离RNA，从而抑制其发挥功能，揭示了PARP1在转录延伸过程中的作用。此项研究的意义在于可以扩展到多个PARP家族成员，并在蛋白质组水平上研究每一个PARP成员如何响应细胞信号刺激【3】。

图1. PARP和ADP-ribosylation相关工作的总结

虽然DNA链断裂是PARP1酶活性激活的刺激源，然而PARP在不同癌症细胞中的激活程度和下游信号通路仍然未知。2017年，余永豪组的研究成果“A Cell Line-Speciﬁc Atlas of PARP-Mediated Protein Asp/Glu-ADP-Ribosylation in Breast Cancer”在Cell reports上在线发表【4】（图1）（第一作者为甄园丽博士）。此研究同样是以上述质谱方法为基础，在不同类型乳腺癌模型中分析ADP-ribosylation谱图。研究人员鉴定分析了322个蛋白上的503个ADP-ribosylation位点，发现尽管不同细胞系中PARP1的蛋白表达水平相近，PARP1在不同乳腺（癌）细胞中激活的程度却大不相同。同时研究人员发现靶蛋白在不同乳腺（癌）细胞中被修饰的程度也不尽相同。研究人员同时利用TMT（Tandem Mass Tag）质谱技术分析了目的蛋白在九个乳腺（癌）细胞中的表达水平，进而将ADP-ribosylation修饰谱和蛋白表达谱做相关性比较分析，发现PARP1对于蛋白的修饰具有明显的细胞特异性，并有效地区分了蛋白在不同细胞系的修饰是源于蛋白表达的特异性还是修饰调节的特异性。这是首次在不同细胞背景下，在蛋白质组学水平比较PARP激活程度和下游信号通路，该研究成果作为重要的资源信息，促进了ADP-ribosylation领域更好地认识PARP上游调节因子和下游输出信号，对于理解其在生理病理条件下的作用有着深刻的影响。特别需要指出的是，核糖体在某些特定的细胞环境中被PARP1所修饰，从而影响蛋白的翻译。这些结果表明，PARylation广泛影响核生物学过程，来调控细胞DNA损伤修复。此外，该研究对将来开发基于ADP-ribosylation修饰来预测PARP抑制剂敏感性的生物标记物同样有着重要的意义（详见BioArt报道：UTSW余永豪组在ADP-ribosylation研究领域取得新突破）。

虽然最初人们认为PARPi是通过抑制PARP1的催化活性来杀死肿瘤细胞的，但是最近的一些研究表明PARPi的细胞毒性作用机制相当复杂，可以归因于两个不同但相互关联的机制。首先，通过抑制PARP1的催化活性（PARP1 catalytic inhibition），这些PARP抑制剂阻断了PAR链的合成，从而抑制PARylation蛋白修饰的发生并阻断PARP1介导的DNA损伤修复信号。第二，PARPi也可能通过诱导PARP1捕获（PARP1 trapping）而杀死癌细胞。一旦PARP1蛋白自身发生PARylation修饰，PARP1就会由于PAR链的空间位阻和电荷排斥作用而脱离DNA损伤的部位。然而，PARPi的处理阻断了PARP1的自修饰，导致PARP1被困在DNA损伤处。这种有毒性的PARP1-PARPi-DNA复合物会导致PARP1捕获并干扰随后的DNA复制，最终导致细胞死亡。然而，PARP1捕获是伴随PARP1催化活性抑制所发生的。因此，PARPi引起的PARP1催化活性抑制和PARP1捕获在功能上完全不同但又存在内在的联系。由于所有FDA批准的PARPi都同时具有催化抑制（PARP1 catalytic inhibition）和捕获（PARP1 trapping）活性，因此，在这两个机制中，到底哪个对PARPi细胞毒性的相对临床贡献更重要目前尚不清楚。因此，亟需建立一种药理学方法将PARP1抑制剂的催化抑制和PARP1捕获分离开来，从而为进一步研究PARP1的催化抑制和PARP1捕获所介导的信号通路，以及各自的功能提供可行的研究手段。

此外，PARP1在一系列非癌症的疾病中（例如缺血再灌注和神经退行性疾病）也会病理性的激活。在这些过程中，自由基会诱导DNA损伤，从而激活PARP1。因为PARP1的高丰度和强大的酶活, PARP1会产生大量的PAR，从而诱导细胞死亡（parthanatos）。此外，PARP1的激活也会大量消耗细胞NAD+，从而导致细胞能量耗竭而死亡。遗传模型显示，PARP1的敲除对这些疾病有着强大的保护作用。但是由于PARP1捕获的高细胞毒性，传统PARPi用于治疗PARP1过度活化引起的非癌性疾病（例如缺血再灌注和神经退行性疾病）的策略也有待商榷，亟需开发出一种模拟PARP1缺失（deletion）的新型化合物（抑制PARP1酶活，但是不造成PARP1捕获）用于该类疾病的治疗。

2019年，余永豪课题组在Nature Chemical Biology杂志上发表了题为“Uncoupling of PARP1 Trapping and Inhibition Using Selective PARP1 Degradation”的研究论文【5】（图1）（第一作者为王帅博士，并得陈绰教授和刘志平教授的大力支持）。为了开发出可以模拟PARP1缺失的小分子化合物，该研究合成并评估了一系列基于PROTAC技术的PARP1降解剂（PARP1 degrader），最终找到了一个具有高度细胞活性和特异性诱导PARP1降解的小分子化合物iRucaparib-AP6。如前所述，传统PARP1抑制剂的作用机制一方面是阻断PARP1下游信号，另一方面是诱导PARP1捕获。通过ADP-ribosylation修饰蛋白质组学分析，课题组发现Rucaparib和iRucaparib-AP6调控着相同的PARP1下游信号。随后对DNA损伤情况下PARP1捕获的研究发现，PARP1抑制剂Rucaparib处理导致大量PARP1蛋白粘附在染色质上形成PARP1捕获，而iRucaparib-AP6处理诱导PARP1发生降解从而不发生PARP1捕获。与之相一致的是，Rucaparib处理造成DNA损伤的大量累积并抑制细胞的增殖。而iRucaparib-AP6处理则完全没有类似的现象。此外，DNA烷化剂甲磺酸甲酯（MMS）处理会诱导癌细胞死亡，联合使用PARP1抑制剂Rucaparib显著促进MMS引起的细胞死亡；但是，联合使用PARP1降解剂iRucaparib-AP6仅稍微提高了细胞死亡率，进一步证明了PARP1捕获在PARP1抑制剂抗肿瘤作用中发挥着十分重要的功能。随后，课题组利用原代心肌细胞和体外分化的肌肉细胞模型评估了iRucaparib-AP6在缺血性损伤中的治疗价值。PAPR1在损伤刺激下可以被过度激活，过度活化的PARP1一方面催化ADP-ribosylation修饰产生大量的PAR，导致死亡信号分子PAR的积累，从而激活PARP1依赖的程序性细胞死亡途径；另一方面也会消耗大量的NAD+而导致NAD+的耗竭，从而激活NAD+的补救合成途径（利用ATP合成NAD+），进而使得ATP水平降低而引起细胞内能量危机，并最终导致细胞坏死。通过对肌肉细胞缺血再灌注损伤的细胞模型进行分析，研究人员发现iRucaparib-AP6和Rucaparib均能够保护肌肉细胞免受缺血性损伤所导致的能量危机和细胞死亡；但是Rucaparib处理会产生明显的PARP1捕获和DNA损伤的累积。此外，传统的PARP1抑制剂Rucaparib处理还会阻碍肌肉前体细胞的正常增殖，而iRucaparib-AP6处理则未发生上述这些副作用。

该项研究开发的一系列针对PARP1 PROTAC的化合物能够有效降解PARP1，达到抑制PARP1但是避免捕获PARP1 的效果，从而将PARP1抑制剂的催化抑制和PARP1捕获活性分离开来，为研究PARP1的催化抑制和PARP1捕获所介导的特异性下游信号和功能，深入理解PARP1抑制剂引起的细胞毒性，以及PARP1捕获的内在机制和功能提供了新的技术手段；同时，该研究也为治疗PARP1过度活化引起的病理损伤（如缺血再灌注损伤，和神经推行性疾病）的治疗提供了可行性的技术手段和潜在的靶向药物（详见：Nat Chem Bio |余永豪组利用靶向蛋白质降解分离PARP1抑制剂的催化抑制和捕获活性机制）。

图2. PARP1特异降解PROTAC化学物的结构

2020年8月26日，余永豪组的最新研究成果“PARP1 inhibitors trigger innate immunity via PARP1 trapping-induced DNA damage response”在eLife上在线发表【6】（图1，3）（第一作者为Chiho Kim博士）。最新的研究揭示PARP1抑制剂在调控肿瘤细胞天然免疫过程中发挥重要的作用。然而，基于PARPi同时具有PARP1催化抑制和PARP1捕获的活性，这两种机制对于PARPi诱导先天性免疫信号传导的相对贡献仍不清楚。此研究发现PARPi诱导产生的dsDNA通过cGAS-STING途径激活先天性免疫反应。利用一系列具有不同PARP1捕获能力的临床相关的PARPi以及“非捕获”的PARP1 PROTAC证实：PARPi激活先天性免疫反应功能主要依赖于PARP1捕获（PARP1 trapping），而不是PARP1抑制（PARP1 inhibition）（图3）。PARPi诱导先天免疫在人类恶性肿瘤治疗中发挥了重要作用，具有更强的PARP1 捕获能力的抑制剂会有更好的治疗效果。同时，“非捕获”的PARP1 PROTAC分子可以避免天然免疫反应的激活，这在非肿瘤疾病的治疗领域也有重要的意义。

图3. 余永豪组的最新研究成果在eLife上在线发表

总的来说，虽然目前已经有4种小分子PARP1抑制剂（PARPi）成为美国FDA 批准的抗癌药物，并取得了非常优秀的治疗效果，然而PARPi真正的工作原理仍然没有完全被解析。对于PARP抑制和PARP捕获的分子机制还有大量的工作值得探索。这对开发下一代的PARP抑制剂，并拓展其适应症将会有巨大的意义。除了上述提到的研究人员，其他参与PARP项目的研究组成员包括王旭东博士和历鹏博士。除了ADP-ribosylation，近年来，余永豪课题组一直致力于开发基于质谱的大规模定量蛋白质组学技术，并将其应用于系统性地鉴定人类蛋白质组中新的蛋白质修饰。课题组秉持“技术结合科学问题”的理念，将蛋白质组学数据与经典的生化，细胞生物学以及动物模型相结合，来研究这些修饰的调控和生物学机制，并促进相关治疗策略的发展.

原文作者：余永豪

原文出自： https://mp.weixin.qq.com/s/Z71BfnZNLtcJKZn862Bm1w

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